Kwantificering van nucleïnezuren in spectrofotometers
De kwantificatie van nucleïnezuren is de meest frequent gebruikte functie van een spectrofotometer. Oligonucleotiden, enkelstrengs, dubbelstrengs DNA en RNA kunnen worden gekwantificeerd in buffers. De absorptiepiek van de hoogste absorptiepiek van nucleïnezuur is 260 nm. Elk nucleïnezuur heeft een verschillende moleculaire samenstelling en heeft daarom verschillende conversiefactoren. Om verschillende typen nucleïnezuren te kwantificeren, selecteert u van tevoren de bijbehorende coëfficiënten. De absorptie van 1 OD is bijvoorbeeld equivalent aan 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA en 30 μg / ml Olig, respectievelijk. De absorptiewaarde na de test wordt omgezet met de bovenstaande coëfficiënt om de overeenkomstige monsterconcentratie te verkrijgen. Selecteer voorafgaand aan het testen de juiste procedure, voer de volumes van de stamoplossing en het verdunningsmiddel in en test de blanco en monsteroplossingen. Het experiment was echter niet eenvoudig. Instabiele lezingen zijn misschien wel de grootste hoofdpijn voor experimenteerders. Hoe hoger de gevoeligheid van het instrument, hoe groter de getoonde absorptiedrift.
In feite laten het ontwerpprincipe en het werkingsprincipe van de spectrofotometer toe dat de absorptiewaarde binnen een bepaald bereik verandert, dat wil zeggen dat het instrument een zekere mate van nauwkeurigheid en nauwkeurigheid heeft. Zoals Eppendorf Biofotometer nauwkeurigheid ≤ 1,0% (1A). De resultaten van deze meerdere tests variëren tussen het gemiddelde van 1,0% en zijn allemaal normaal. Daarnaast moet ook rekening worden gehouden met de fysisch-chemische eigenschappen van het nucleïnezuur, de pH van de buffer voor het oplossen van het nucleïnezuur, de ionenconcentratie, enz. Tijdens de test zal een te hoge ionenconcentratie ook de uitlezing veroorzaken. afdrijven als TE, wat de aflezing sterk zal stabiliseren. De verdunde concentratie van het monster is ook een niet-verwaarloosbare factor: vanwege de onvermijdelijke aanwezigheid van kleine deeltjes in het monster, vooral nucleïnezuurmonsters. De aanwezigheid van deze kleine deeltjes interfereert met het testeffect. Om de invloed van de deeltjes op de testresultaten te minimaliseren, moet de absorptie van het nucleïnezuur ten minste 0,1 A zijn en de absorptie is bij voorkeur 0,1-1,5 A. In dit bereik mogen geen luchtbellen aanwezig zijn mengsel, en er is geen suspensie in de blanco. Anders lopen de meetwaarden heftig; dezelfde colorimetrische beker moet worden gebruikt om de blanco en het monster te testen; anders is het concentratieverschil te groot; de conversiecoëfficiënt en de monsterconcentratie-eenheid zijn hetzelfde; De cuvette gedragen door het raam; het volume van het monster moet meer zijn dan het vereiste minimumvolume van de kleurenbeker, enz.
Naast de nucleïnezuurconcentratie vertoont de spectrofotometer verschillende zeer belangrijke verhoudingen tegelijkertijd om de zuiverheid van het monster aan te geven, zoals de A260 / A280-verhouding, voor het beoordelen van de zuiverheid van het monster, aangezien de absorptiepiek van het eiwit is 280 nm. Zuivere monsters hebben een verhouding groter dan 1,8 (DNA) of 2,0 (RNA). Als de verhouding kleiner is dan 1,8 of 2,0, geeft dit de aanwezigheid van proteïne of fenolische stoffen aan. A230 geeft aan dat er enkele verontreinigingen in het monster zijn, zoals koolhydraten, peptiden, fenolen, enz. De verhouding van zuiver nucleïnezuur A260 / A230 is groter dan 2,0. A320 detecteert de troebelheid van de oplossing en andere interferentiefactoren. Zuiver staal, A320 is over het algemeen 0.
Het bedrijf is gespecialiseerd in de verkoop van spectrofotometers , graag geziene klanten die moeten worden geraadpleegd en gekocht, we zullen u voorzien van oprechte service- en kwaliteitsproducten, evenals lagere prijzen.
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com